Identificando protozoários e algas em amostras ambientais
Muita gente mistura os dois grupos quando começa a trabalhar com micologia aquática ou análise de água. Protozoários são eucariotos unicelulares heterótrofos, basicamente. Algas são fotossintetizantes, podem ser unicelulares ou multicelulares. A confusão acontece no laboratório porque algumas flageladas estão na fronteira entre os dois reinos, tipo os dinoflagelados que têm cloroplastos mas se alimentam por fagocitose também. Eu comecei a trabalhar com isso em estações de tratamento de água há uns doze anos. O problema real não é a teoria, é a prática. Quando você pega uma amostra de lago ecola num espectrofotômetro, o resultado pode ser completamente distorcido se não souber o que está vendo.
Protozoários e algas: como coletar e preservar
A coleta depende do que você quer analisar. Para protozoários livres, use frascos de vidro escuros com tampa, volume mínimo de 500ml, coletados a cerca de cinco centímetros da superfície. Se o objetivo for bentônicos, recolha o sedimento superficial com uma draga de Van Veen. Para algas filamentosas, o ideal é amostrar diferentes profundidades porque a zonacação vertical é real e significativa. A preservação varia conforme o grupo. Para protozoários, o formaldeído a 4% é o padrão histórico, mas eu migrei para o lugol modificado por iodeto de potássio porque preserva melhor a morfologia de cistos. Algas fixam melhor em glutaraldeído a 2% ou mesmo refrigeradas a 4°C se o processamento for dentro de 48 horas. Já vi gente usar etanol 70% para ambos os grupos e ter resultados ruins de identificação taxonômica depois. Não recomendo.
O prazo de processamento é onde a maioria erra. Amostras de protozoários não devem ficar mais que 24 horas paradas antes da concentração, senão os cistos perdem viabilidade e os flagelados se autolisam. Algas aguentam até 72h se bem refrig era conservadas, mas a composição da comunidade pode mudar por crescimento diferencial de espécies oportunistas.
Microscopia e identificação prática
A técnica de concentração mais usada é a sedimentação direta com formaldeído ou lugol. Você deixa a amostra repousar em cilindro Imhoff por 24 horas, descarta o sobrenadante, ressuspende o sedimento em pouco volume e coloca na câmara de Sedgwick-Rafter. Isso reduz o tempo de busca no microscópio de algo em torno de 40 minutos por lâmina para cerca de 8 minutos. O contra que ninguém conta: a sedimentação tende a favorecer protozoários maiores e mais densos. Rotíferos e cistos pesados de cercozoários vão para o fundo rápido. Flagelados pequenos e diatomáceas muito leves podem permanecer na colutima superior e ser subestimados se você pipetar apenas o sedimento final. Eu resolvi isso adicionando uma etapa de centrifugação baixa, 300g por 5 minutos, antes da sedimentação. Captura o que a gravidade sozinha perde.
Para algas, o método Utermöhl com câmara de inverted é o padrão ouro. Decantação de 12 a 24 horas e contagem em microscópio invertido. A vantagem é que as células mais densas sedimentam primeiro, permitindo focar progressivamente. O ponto cego são as cianobactérias filamentosas pequenas e as criptófitas, que ficam suspensas e exigem contagem integrada com filtros de 5 e 3 micrômetros.
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Casos práticos que aprendi na mão
Numa ocasião, monitorei um reservatório com floração intensa de cianobactérias. Os relatórios semanais indicavam queda gradual de protozoários indicadores de qualidade, como Vorticella e Aspidisca. Achei que era poluição orgânica. Continuei por meses com esse diagnóstico, tratando o efluente como se estivesse sobrecarregado. A virada veio quando um técnico mais velho me pediu para olhar a lamínula com maior aumento. As "ausências" de protozoários era ilusão de ótica microscópica. O fitoplâncton denso, principalmente Microcystis aeruginosa, mascarava os ciliados no campo de visão. Eu estava contando apenas o que conseguia ver sobre o tapete de algas, não a comunidade real. A solução foi fazer digestão enzimática leve com papaína a 0,1% por 15 minutos para romper os agregados de cianobactérias e libertar os protozoários aderidos. Depois disso, a densidade de Vorticella voltou ao esperado, em torno de 120 indivíduos por ml, compatível com o nível de tratamento.
Outro erro comum é confiar na coloração de Gram para diferenciar grupos. Protozoários têm parede celular variável, muitos não coram de forma confiável. Algas geralmente não entram na classificação de Gram também. Se precisar diferenciar viabilidade, use azul de tripan ou iodto de iodo para amido em algas. Para protozoários, a fluorescência com DAPI e colorações específicas como a de Giemsa para formas trofozoíticas funcionam melhor.
Limitações e onde o método falha
A concentração por sedimentação não recupera protozoários formadores de biofilmes aderidos a superfícies. Se seu interesse inclui cistos fixados em substrato, precisa fazer raspagem mecânica e ultrassom por 10 minutos para dessoldar. Sem isso, a contagem pode subestimar a carga real em até 60%. Para algas, a identificação morfológica exige experiência real com chaves dicotômicas atualizadas. Espécies cripticas de Chlamydomonas e dinoflagelados do gênero Gymnodinium são indistinguíveis ao microscópio óptico comum. Se o laboratório não tem PCR ou sequenciamento de barcoding, o melhor é reportar até o nível de gênero com a ressalva de possível cripspecie. Mandar relatório com espécie exata nesse caso é imprecisão disfarçada de precisão.
O custo operacional também não é baixo. Lugol, glutaraldeído, câmaras de contagem e microscópio invertido com fotomultiplicador colocam o custo por amostra em torno de 80 a 150 reais, sem contar a mão de obra especializada. Se o volume for alto e o foco for apenas biomassa algal, a clorofila-a por fluorometria é mais rápida e barata, embora perca a informação taxonômica completa.
Dica técnica direta
Quando trabalhar com protozoários e algas juntos na mesma amostra, separe os protocolos desde a coleta. O lugol usado para protozoários precipita alguns pigmentos algaes e escurece a amostra, dificultando a identificação fotossintetizante depois. Use frascos diferentes, um para cada grupo, desde o início. Isso economiza tempo e evita retrabalho que gera erro de contagem.
