O que acontece quando uma bactéria se divide
A reprodução das bacterias acontece, na grande maioria dos casos, por um processo chamado fissão binária. Uma célula cresce, replica seu material genético e depois se parte em duas células filhas geneticamente idênticas. Não tem segredo. O tempo de geração varia entre espécies: E. coli em meio rico pode levar cerca de 20 minutos, mas a mesma espécie em meio mínimo com fonte de carbono menos eficiente pode levar 60 minutos ou mais. Na prática laboratorial, isso significa que um inoculo pequeno pode chegar à fase exponencial em poucas horas se o meio for adequado. Se você preparar o meio com concentrações erradas de sais ou aminóácidos, a curva de crescimento simplesmente não vai parecer com o que a literatura descreve. Já perdi uma noite inteira tentando diagnosticar por que meu lag phase estava com 3 horas em vez das 30 minutos esperadas. O problema era um lote de agar com pH fora da faixa. Ajustei e o tempo de lag voltou ao normal na sequência seguinte.
Entendendo a reproducao das bacterias na pratica
O ciclo celular bacteriano tem três fases distintas: o período B, onde a célula se prepara para a replicação do DNA; o período C, que corresponde à replicação do cromossomo em si; e o período D, onde a divisão celular propriamente dita ocorre. Para E. coli K-12, o período C dura aproximadamente 40 minutos e o período D cerca de 20 minutos. O período B é variável e depende das condições ambientais. O que a maioria dos iniciantes não percebe é que, em crescimento rápido, as gerações podem se sobrepor. Uma bactéria começando um novo ciclo de replicação antes mesmo de terminar a divisão anterior. Isso significa que em cultura de fase exponencial com tempo de geração menor que 60 minutos, você pode encontrar células com múltiplas origens de replicação e cromossomos parcialmente duplicados coexistindo na mesma célula. Um protocolo de extração de DNA que funciona bem para células em fase estacionária pode dar resultado ruim com células em crescimento acelerado porque a quantidade de DNA por célula é maior e a viscosidade do lisado aumenta significativamente.
Se você está medindo densidade óptica para acompanhar o crescimento, lembre-se que absorbância a 600 nm (OD600) só é linear até aproximadamente 0,4 a 0,5. Acima disso, espalhamento de luz distorce a leitura. Dilua a cultura 1:10 ou 1:20 e meça novamente. É um erro comum que gera curvas de crescimento com platôs falsos na fase exponencial.
Fatores que alteram a velocidade de divisao
Temperatura, pH, disponibilidade de nutrientes, concentração de oxigênio (para aeróbios) e presença de substâncias inibidoras são os principais fatores. Temperatura ótima para mesófilos como E. coli fica em torno de 37°C. Cada grau acima ou abaixo já altera a taxa de crescimento. Em 42°C, a divisão pode cair pela metade. Em 20°C, praticamente para. Concentração de oxigênio é crítica e muitas vezes subestimada. Culturas agitas em erlenmeyer com volume que excede 20% da capacidade do frasco não recebem oxigênio suficiente para manter crescimento exponencial máximo. A relação volume/area superficial limita a transferencia de O2. Um frasco de 250 mL com apenas 25 mL de meio e agitação a 250 rpm pode ter taxa de crescimento significativamente menor que um frasco de 500 mL com o mesmo volume, simplesmente por ter maior área de superfície exposta.
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Sobre pH: meios de cultura padrão como LB ou SOC têm buffer fraco. À medida que as bactérias crescem, metabolitam aminoácidos e produzem ácidos orgânicos que baixam o pH. Em culturas densas, o pH pode cair de 7,0 para 6,0 ou menos em poucas horas. Isso retarda o crescimento e pode induzir resposta de estresse ácido. Se você precisa de crescimento sustentado por muitas gerações, um meio com buffer como M9 suplementado com CAPS ou HEPES resolve esse problema.
Métodos alternativos de transferencia genetica
É importante distinguir reprodução assexuada de troca genética. Conjugação, transformação e transdução não aumentam o número de células, mas introduzem variabilidade genética. Na conjugação, uma bactéria doadora com plasmídeo F transfere cópia do plasmídeo através de um pilus para uma receptora. Isso ocorre com frequência de 10^-1 a 10^-6 por pareamento, dependendo da cepa e condições. Na transformação natural, bactérias competentes absorvem DNA livre do meio. Isso é comum em Bacillus e Streptococcus, mas E. coli laboratorial comum não é naturalmente competente — precisa ser quimicamente tratada com CaCl2 ou eletroporada. Na transdução, fagos carregam DNA bacteriano de uma célula para outra. Transdução generalizada permite transferência de qualquer gene; transdução especializada transfere apenas genes próximos ao sítio de integração do profago. Ambas são ferramentas importantes em mapeamento genético, mas a eficiência varia muito: transdução generalizada típica rende 10^2 a 10^8 transductantes por µg de DNA fágico.
Erros comuns em cultivos e como contorna-los
O primeiro erro que vejo todo dia é gente usar cultura de placa para inocular meio líquido sem verificar pureza. Uma placa com colônias morfologicamente distintas significa mistura. Inocular e torcer pelo melhor é perda de tempo. Escolha uma colônia isolada, passe em nova placa para reconfirmar e só então faça o inoculo. Outro erro recorrente é armazenar linhagens em glicerol 15% a -80°C e descongelar completamente para fazer um único inoculo. Cada ciclo de congelamento e descongelamento reduz a viabilidade em 10 a 50%, dependendo da cepa. Alíquote em tubos de 1 mL e descongele apenas o necessário. Glicerol a 15% v/v é o padrão porque concentrações maiores aumentam a pressão osmótica durante o choque térmico e matam mais células.
Quando se trabalha com bactérias de crescimento lento, como Mycobacterium tuberculosis que leva 16 a 24 horas por divisão, o tempo de incubação necessário para visualizar colônias em placa pode ser de 3 a 8 semanas. Isso exige meios especiais (Lowenstein-Jensen ou Middlebrook) e controle rigoroso de biossegurança nível 3. Tentar usar protocolos de E. coli com micobactérias é falha garantida — o tempo de geração é 100 a 500 vezes maior. Em relação à reproducao das bacterias, o ponto mais ignorado é a fase de estacionária. Quando os nutrientes se esgotam, as bactérias param de se dividir e entram em um estado de sobrevivência. Muitas espécies produzem esporos ou entram em dormincência. Se você pega cultura em fase estacionária para qualquer experimento de transformação ou expressão proteica, os resultados serão inconsistentes porque a fisiologia celular é completamente diferente da fase exponencial. Sempre use cultura na fase logaritmo tardio (OD600 entre 0,5 e 0,8 para E. coli) para experimentos que exigem cells metabolicamente ativas.
