O que realmente acontece quando você usa topoisomerase no laboratório
Topoisomerase I e topoisomerase II são enzimas que resolvem problemas topológicos do DNA que aparecem todo dia em protocolos de clonagem, digestão com restrição e montagem de bibliotecas. A maioria dos manuais trata elas como um detalhe do protocolo, mas o resultado do seu experimento depende diretamente de quanto você entende o que cada uma faz e, mais importante, quando falha.
Topoisomerase i ii na prática
A topoisomerase I corta uma fita do DNA, permite que a outra gire e se religa. Ela relaxa superenrolamento sem gastar ATP. A topoisomerase II corta as duas fitas, passa outro segmento duplex através do corte e religa. Ela requer ATP e pode resolver nós, entrelaçamentos e superenrolamento positivo ou negativo. Em laboratório, a topoisomerase I é a que você vai usar mais seguido, geralmente na forma comercial do Promega ou equivalents mais baratos de outras marcas. O que não contam nos materiais fornecidos pela empresa: a topoisomerase I de bacteriófago lambda (TOPO cloning system) tem uma cinética muito específica que precisa de tempo de incubação adequado. Se você incuba por menos de 5 minutos em temperatura ambiente, a eficiência de clonagem cai para algo em torno de 10% a 20% do esperado. Se incubou por mais de 30 minutos, a enzima começa a degradar o inserto por atividade exonucleolítica residual. O tempo ideal fica entre 10 e 15 minutos na maioria dos casos.
👉 Clique no botão abaixo para saber mais sobre o assunto!
Uma coisa que todo mundo subestima é a qualidade do DNA que você está usando como substrato. DNA isolado com kit de coluna tem sal residual e etanol que inibem a topoisomerase de forma significativa. Eu fiz uma experiência onde o mesmo inserto deu 15 clones com DNA purificado por fenol-clorofórmio e apenas 2 clones com DNA de coluna, tudo o mais igual. A solução foi uma lavagem adicional com etanol 70% e secagem completa sob fluxo de bancada por 15 minutos antes de usar no reaction. A topoisomerase II, por sua vez, é muito menos usada em protocolos de rotina. Quando aparece, é em situações de montagem de múltiplos fragmentos, como em Golden Gate ou no sistema de topoisomerase da New England Biolabs para cloning de fragments grandes. O ponto crítico aqui é que a topoisomerase II não tolera bem concentrationes altas de PEG ou etanol no buffer. Se o seu DNA final tiver mais de 5% de etanol residual, a atividade cai drasticamente. Sempre verifique isso se o cloning não está funcionando.
Outro detalhe que pouca gente leva a sério: a concentração de Mg2+. Tanto a topo I quanto a topo II dependem de íons magnésio para a atividade catalítica. O buffer padrão já contém a concentração certa, mas se você estiver fazendo um diluição extrema do DNA ou usando um volume de reação muito pequeno, o Mg2+ pode ser consumido por fosfato livre ou outros quelantes presentes na preparação. Eu já vi protocolos falharem porque o DNA estava em TE com 1mM EDTA. O EDTA quelou o Mg2+ da reação. Trocar o buffer por água nuclease-free resolveu o problema na hora. Há também uma armadilha comum com a topoisomerase II: ela pode induzir superenrolamento negativo em vez de relaxar, dependendo das condições iônicas e da presença de ATP. Se você está usando topo II para preparar DNA para transfeção ou para eletroforese em gel de agarose, e o gel mostra bandas com mobilidade anômala, verifique se a reação estava com ATP fresco. ATP degradado para ADP altera completamente o comportamento da enzima, e o resultado é DNA com superenrolamento incorreto que migra de forma imprevisível no gel.
O que eu recomendo como prática mínima: sempre inclua um controle negativo sem inserto e um controle positivo com DNA circular conhecido na mesma placa. Isso leva 20 minutos a mais mas economiza horas de frustração depois. E nunca confie na validade da enzima apenas pela data de validade no frasco. Se o frasco foi aberto e fechado várias vezes, ou se passou por ciclos de congelamento e descongelamento, a atividade pode estar abaixo do que o datasheet promete. Aliquota o enzyme uma vez e nunca recongele.
