Exemplos De Centrifugação

Como funciona a centrifugação na prática

A centrifugação é uma técnica de separação baseada na diferença de densidade dos componentes de uma amostra. Quando o tubo gira em alta velocidade, as partículas mais densas são empurradas para o fundo primeiro, enquanto as mais leves permanecem na parte superior. Parece simples, mas a execução é onde a maioria dos erros acontece. Antes de pensar nos exemplos, é preciso entender que o que realmente importa não são os RPMs do display, mas a força centrífuga relativa (RCF) expressa em x g. Rotores diferentes com o mesmo número de rotações produzem forças diferentes porque o raio de giratória varia. Um protocentro de 3000 rpm com raio de 10 cm gera cerca de 715 x g. O mesmo 3000 rpm num rotor de raio 15 cm gera 1072 x g. Sempre converter com a fórmula RCF = 1,118 × 10 × r × (RPM)² quando a centrífuga não exibe o valor diretamente.

Exemplos de centrifugação mais comuns no laboratório

O exemplo mais frequente é a separação do sangue total em plasma ou soro. Pega-se um tubo com EDTA ou heparina, centrifuga-se a 1500-2000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. O componente celular forma um pellet compacto no fundo e o plasma fica sobrenadante. O erro comum aqui é centrifugar logo após a coleta sem homogeneizar bem com o anticoagulante primeiro. Se o sangue não estiver bem misturado, formam-se microcoágulos que entopem pipetas depois e alteram os resultados das análises clínicas. Outro exemplo clássico é a precipitação de ácidos nucleicos com etanol ou isopropanol. Após a lysed da célula e a precipitação com etanol 70% a 100%, centrifuga-se a 12000 x g por 5 a 10 minutos. O DNA ou RNA forma um pellet gelatinoso, muitas das vezes invisível a olho nu. A dica prática aqui é não descartar o sobrenadante imediatamente. Deixa-se o tubo invertido sobre papel de filtro por dois minutos para drenar o álcool residual antes da ressuspenção. Se o pellet secar demais, a ressuspensão fica muito mais demorada e pode prejudicar downstream como PCR ou digestão enzimática.

Na purificação de proteínas por sulfato de amônio, a centrifugação remove os precipitados proteicos após a saturação da salmoura. Geralmente se usa 10000 x g por 15 minutos a 4 °C. A temperatura importa porque algumas proteínas desnaturam com o calor gerado pelo atrito do rotor. Centrifugar sem tampa pré-resfriada ou sem use de rotor refrigerado pode elevar a temperatura da amostra em 3 a 5 °C durante o ciclo, suficiente para perda significativa de atividade enzimática em proteínas sensíveis. Para isolamento de organelas, como mitocôndrias de tecido hepático, emprega-se centrifugação diferencial. Primeiro uma baixíssima força, 600 x g por 10 minutos, para remover núcleos e detritos celulares. O sobrenadante é transferido para um novo tubo e centrifugado a 10000 x g por 15 minutos para obter o pellet mitocondrial. Cada passo depende do anterior. Se o primeiro spin não remover tudo que é pesado, o pellet mitocondrial fica contaminado com fragmentos nucleares, o que estraga qualquer ensaio funcional subsequente.

Um caso que merece atenção especial é a separação de partículas virais ou lipoproteínas por gradiente de densidade. Aqui se usa sacarose ou cesio cloreto em gradiente contínuo ou em camadas. A amostra é sobreposta e centrifugada a 100000 x g ou mais por várias horas. O resultado não é um pellet, mas bandas visíveis em posições específicas do tubo correspondentes à densidade de cada partícula. Esse tipo de centrifugação exige tubos especiais resistentes a alta pressão e rotores de ângulo fixo ou swinging bucket adequados. Tentar fazer isso num rotor de hélice comum é pedir para ter um acidente sério com o rotor. Na microbiologia, a coleta de bactérias a partir de cultura líquida é feita tipicamente a 4000 x g por 5 a 10 minutos. O pellet bacteriano pode parecer fofinho e difícil de ressuspender. Adicionar um volume pequeno de buffer de ressuspensão e passar por pipetagem repetida com ponta cortada resolve. O corte na ponta reduz a tensão superficial e evita que as bactérias grudem nas paredes do plástico.

O que ninguém conta sobre centrifugação

O desbalanceamento é o problema número um. Dois tubos opostos precisam ter peso idêntico, não apenas volume idêntico. Um tubo com 50 mL de meio de cultura pesa diferente de outro com 50 mL de extrato bruto mais viscoso. Usar balança de precisão para checar antes de fechar a tampa economiza consertos caros. Já vi rotor rachado por causa de um balanceamento descuidado com tubos de polipropileno de espessuras diferentes. Outro ponto negligenciado é a altura do fill. Tubos superlotados têm turbulência interna que mistura frações que deveriam permanecer separadas. Para separações de organelas, encher o tubo até 80% da capacidade é o suficiente. O espaço livre permite que o gradiente se forme sem convecção indesejada durante a aceleração e desaceleração.

A desaceleração também importa. many centrífugas permitem ajustar a taxa de freio. Se você usa rotor de swinging bucket e coloca o brake alto, o painel para de cair bruscamente e redistribui o pellet já formado. Para trabalhos delicados como isolamento de membranas ou RNA, deixar o rotor parar naturalmente ou usar brake baixo evita recombinar camadas que levaram horas para se estabilizar. Há ainda o problema da evaporação. Ciclos longos a alta temperatura geram perda de volume, especialmente em tubos não sellados herméticamente. Usar tampas com silicone ou fita parafilms reduz essa perda para menos de 5% em horas de centrifugação. Sem isso, a concentração final da amostra pode variar significativamente entre replicatas, o que compromete dados quantitativos.

Finalmente, a escolha do material do tubo. Polipropileno aguenta solventes orgânicos e centrífuga a altas G. Poliestireno deforma e pode rachar. Tubos de vidro são bons para certas aplicações mas pesam mais e exigem adaptadores específicos. Escolher o tubo errado pode significar perda total da amostra quando o tubo estoura dentro do rotor. Nunca coloque amostras valiosas em tubo que não foi testado para a força que você vai aplicar.